NIBIO arbeider med å sikre friskt plantemateriale og bevare verdifulle genetiske ressurser gjennom diagnostikk, virusrensing, meristem- og vevskultur, kontrolltesting, oppformering og metoder for langtidsbevaring. Arbeidet omfatter blant annet potet, jordbær, bringebær, sjalottløk, hvitløk, eple, pære, stauder og andre hagebruksvekster, og gjennomføres i samarbeid med aktører innen planteforedling, genressursbevaring, oppformering og planteproduksjon i jord- og hagebruk.
(+47) 942 57 170zhibo.hamborg@nibio.no
Kontorsted:
Ås - Bygg H7
Fakta vevskultur
Vevskultur, eller in vitro-kultur, er dyrking av plantevev under sterile og kontrollerte forhold på et definert vekstmedium. Metoden brukes til å regenerere, oppformere og vedlikeholde plantemateriale.
I arbeidet med friskt plantemateriale er vevskultur særlig viktig ved meristemkultur og virusrensing, og for bevaring av vegetativt formerte genetiske ressurser.
Fakta: Meristem
Meristem er plantevev med aktivt delende, udifferensierte celler som danner grunnlaget for plantens vekst. Meristemer finnes blant annet i skudd- og rotspisser.
I det apikale meristemet kan viruskonsentrasjonen være svært lav eller virus kan være fraværende, noe som gjør dette vevet spesielt interessant ved virusrensing.
Fakta: Meristemkultur
Meristemkultur er dyrking av et isolert meristem under sterile in vitro-forhold. Virus er ofte ujevnt fordelt i planten, og viruskonsentrasjonen kan være svært lav eller virus kan være fraværende i de yngste delene av det apikale meristemet.
Ved virusrensing isoleres derfor et svært lite meristem, ofte ca. 0,2–0,5 mm, som regenereres til en ny plante. Dette kan gjøre det mulig å etablere virusfritt plantemateriale.
Fakta: Varmebehandling (termoterapi)
Varmebehandling eller Termoterapi innebærer at plantemateriale eksponeres for forhøyet temperatur, ofte omkring 36–42 °C over flere uker, for å hemme virus og øke sannsynligheten for å regenerere virusfrie planter. Metoden kombineres ofte med meristemkultur. Temperatur og behandlingstid må tilpasses planteart, virus og plantens varmetoleranse.
Fakta: Kjemoterapi
Kjemoterapi innebærer behandling av infisert plantemateriale med antivirale forbindelser som hemmer virusreplikasjon. Behandlingen utføres vanligvis in vitro og kan kombineres med meristemkultur. Ribavirin og salisylsyre er eksempler på forbindelser som kan brukes.
Behandlingen må tilpasses slik at virus hemmes uten at plantevevet skades.
Fakta: Kryoterapi
Kryoterapi er en metode for virusrensing der små skuddspisser eller vekstpunkter eksponeres kortvarig for flytende nitrogen ved −196 °C. Behandlingen dreper i hovedsak større og mer differensierte celler, mens en liten gruppe meristematiske celler i den apikale delen av vekstpunktet kan overleve. Disse cellene har ofte lav viruskonsentrasjon eller kan være virusfrie.
Det overlevende meristemet kan deretter regenereres in vitro til en ny plante. Kryoterapi bygger dermed på en selektiv overlevelse av meristematiske celler og kan brukes alene eller i kombinasjon med andre metoder for virusrensing.
Fakta: Kryopreservering
Kryopreservering er langtidsbevaring av levende plantemateriale ved ultralav temperatur, vanligvis i flytende nitrogen ved −196 °C. For vegetativt formerte planter brukes ofte små vekstpunkter eller skuddspisser. Ved denne temperaturen stanses biologiske prosesser i praksis, slik at genetisk materiale kan sikres over lang tid med minimalt behov for kontinuerlig oppformering.
Hvorfor trenger vi friskt plantemateriale?
Friskt utgangsmateriale er et viktig forebyggende tiltak for god plantehelse. Dette er særlig viktig for vegetativt formerte vekster. Vegetativ formering gjør det mulig å bevare sortenes genetiske egenskaper, men innebærer samtidig at virus og andre systemiske skadegjørere kan følge med plantematerialet fra morplanten til neste generasjon.
Bruk av kontrollert og friskt utgangsmateriale kan derfor redusere risikoen for at smitte introduseres og videreføres gjennom formeringsmaterialet. Diagnostikk, virusrensing og kontrolltesting er sentrale tiltak for å bryte denne smitteveien før plantematerialet går videre til oppformering og produksjon.
NIBIO kombinerer plantehelsefaglig kompetanse med diagnostikk, virusrensing, meristem- og vevskultur, kontrolltesting, oppformering og langtidsbevaring for å etablere, kvalitetssikre og bevare friskt plantemateriale. For produksjonssystemer der sertifisering inngår, kan dokumentert friske utgangsmaterialet danne grunnlag for videre oppformering i sertifiserte systemer.
Fra plantehelse til friskt utgangsmateriale
Denne kjeden knytter sammen påvisning og håndtering av smitte med etablering, kvalitetssikring, oppformering og langsiktig bevaring av friskt plantemateriale og genetiske ressurser.
Diagnostikk og Kontrolltesting
Påvisning av virus og andre planteskadegjørere er en sentral del av arbeidet med friskt plantemateriale. Avhengig av planteart og problemstilling benyttes blant annet bioassay, ELISA, RT-PCR, RT-qPCR og dypsekvensering (high throughput sequencing - HTS).
Diagnostikken brukes både til å undersøke helsestatus i plantematerialet og til å kontrollere resultatet etter virusrensing. Etter behandling må hver enkelt plante testes for aktuelle virus. Testingen kan gjennomføres både på materiale i vevskultur og etter videre dyrking i veksthus. Først når plantene er testet og vurdert som virusfrie, kan de brukes som friskt utgangsmateriale for videre oppformering eller bevaring.
Virusrensing og etablering av friskt plantemateriale
Når verdifullt plantemateriale er virusinfisert, kan virusrensing være nødvendig før materialet oppformeres eller bevares videre. Meristemkultur er en sentral metode. Et svært lite vekstpunkt, vanligvis omkring 0,2–0,5 mm, isoleres og dyrkes på et kunstig vekstmedium for å regenerere nye planter. Effekten varierer mellom plantearter og virustyper, og meristemkultur kan derfor kombineres med andre behandlinger.
For sjalottløk og hvitløk kan meristemkultur kombineres med varmebehandling eller kryoterapi. Valg av metode avhenger blant annet av hvilket virus som skal fjernes og hvordan plantematerialet responderer på behandlingen. For potet kan meristemkultur kombineres med varmebehandling og kjemoterapi, blant annet ved rensing for potetvirus S (PVS) og potetvirus X (PVX).
Etter virusrensing må regenererte planter kontrolltestes før de kan brukes som friskt utgangsmateriale.
Vevskultur og oppformering
Vevskultur gjør det mulig å etablere, regenerere, oppformere og vedlikeholdeholde vegetativt formert plantemateriale under kontrollerte forhold. Metoden er sentral både ved meristemkultur og virusrensing og ved videre vedlikehold og bevaring av friskt plantemateriale og vegetativt formerte genetiske ressurser.
For potet inngår NIBIOs vevskultursamling i Nasjonale klonbanken for potet. Friskt og genetisk definert plantemateriale kan vedlikeholdes i samlingen og brukes som grunnlag for framtidig oppformering, foredling, forskning og bevaring.
Når friskt plantemateriale er etablert og kontrolltestet, kan utvalgt materiale sikres for framtiden.
Kryopreservering innebærer langtidslagring av levende plantevev, vanligvis vekstpunkter eller skuddspisser, ved svært lav temperatur. Materialet lagres normalt i flytende nitrogen ved −196 °C, der biologiske prosesser i praksis stanses.
Kryopreservering kan sikre både plantegenetiske ressurser og plantemateriale med dokumentert helsestatus. Friskt materiale kan først etableres gjennom diagnostikk og eventuell virusrensing, deretter vedlikeholdes og oppformeres i vevskultur før utvalgt materiale sikres gjennom kryolagring. På denne måten kobles plantehelse direkte til langsiktig bevaring av genetiske ressurser.
NIBIO har gjennom mer enn 15 års samarbeid med Sagaplant AS arbeidet med å utvikle og tilpasse metoder for kryopreservering av flere vegetativt formerte plantearter. Arbeidet har blant annet omfattet jordbær, bringebær, potet og eple samt andre bær- og fruktarter. For materiale som allerede er kryopreservert hos Sagaplant, er skuddspisser benyttet som utgangsmateriale og droplet-vitrification som kryopreserveringsmetode.
Protokoll for kryopreservering av potet.
Samlingen i kryotank hos Sagaplant omfatter blant annet potet, jordbær, bringebær, eple, solbær, bjørnebær og plomme. Kryolagringen fungerer som langsiktig bevaring og sikkerhetskopi av verdifullt plantemateriale i Norge.
NIBIO arrangerte ISHS CryoSymp 2023, The IV International Symposium on Plant Cryopreservation, på Holmen Fjordhotell i Oslo, 12.–15. juni 2023.
Arbeid på tvers av plantearter
NIBIOs kompetanse brukes på ulike måter avhengig av planteart, formeringsmåte og behov. Planteartene nedenfor viser bredden i arbeidet og hvordan aktiviteten gjennomføres sammen med relevante fag- og næringsaktører.
Potet
NIBIO har en sentral rolle innen friskt plantemateriale av potet. Arbeidet omfatter karantene, diagnostikk, virusrensing, vintertesting og vedlikehold av materiale i Nasjonal klonbank for potet. Aktiviteten skjer blant annet i samarbeid med Graminor AS, Overhalla klonavlssenter og flere norske potetaktører.
Fremavlssystemet for potet i Norge
Jordbær og bringebær
For jordbær og bringebær arbeider NIBIO med virusdiagnostikk og forskning på virusforekomst, epidemiologi og samspill mellom virus, planter og vektorer. Denne kunnskapen bidrar til å forstå hvordan virus spres og hvordan smitte kan forebygges. NIBIO samarbeider også med Sagaplant om langsiktig bevaring av verdifullt plantemateriale gjennom kryopreservering.
Sjalottløk
For sjalottløk arbeider NIBIO med virusrensing, testing, oppformering og vedlikehold av friskt plantemateriale i samarbeid med Nasjonal klonbank for grønsaker på Landvik og Norsk genressurssenter. Virusfrie sorter vedlikeholdes og oppformeres ved NIBIO Ås, og materiale overføres til klonbanken på Landvik for videre bevaring. Friskt materiale oppformeres også hos Datsja i fjellområder omkring 900 meter over havet for å utnytte et miljø med lavere smittepress
Hvitløk
Arbeidet med hvitløk omfatter kartlegging av virus, utvalg av lovende sorter, virusrensing og oppbygging av friskt klonmateriale. Arbeidet gjennomføres i samarbeid med Norges Vel, Slæpen gård, Datsja, Setteløk AS og NIBIO Apelsvoll, med mål om å utvikle kunnskap og norsktilpasset settemateriale for hobbydyrkere, småskalaprodusenter og framtidig norsk hvitløksproduksjon.
Eple og pære
For eple og pære er friskt formeringsmateriale og langsiktig bevaring av genetiske ressurser viktige deler av arbeidet. Nasjonal klonbank for frukt ved Njøs har en sentral rolle i bevaringen av verdifulle sorter, mens NIBIO bidrar med plantehelsefaglig kompetanse, særlig innen diagnostikk og kunnskap om virus- og fytoplasmasykdommer.
NIBIO arbeider også med utvikling og tilpasning av metoder for kryopreservering av frukt, blant annet kryopreservering av hvilende knopper («dormant buds»). Sagaplant bidrar med kompetanse og erfaring innen kryopreservering og lagring av plantemateriale. Samarbeidet kobler plantehelse, metodeutvikling og genressursbevaring.
Stauder
For stauder og andre vegetativt formerte hagebruksvekster bidrar NIBIO med diagnostikk og plantehelsefaglig kompetanse for å påvise virus i plantematerialet. Sagaplant arbeider med virusrensing og oppformering av friskt plantemateriale, mens samarbeidet med PlantiNor knytter arbeidet til praktisk bruk og videre produksjon.
NIBIOs samlede kompetanse
NIBIO har kompetanse gjennom hele kjeden fra påvisning av planteskadegjørere til etablering og langsiktig bevaring av friskt plantemateriale.
Plantehelse og diagnostikk
Kunnskap om virus, virussykdommer, epidemiologi og virus-vektor-interaksjoner samt diagnostikk ved blant annet bioassay, ELISA, RT-PCR, RT-qPCR og HTS.
Virusrensing og vevskultur
Meristemkultur, varmebehandling, kjemoterapi og kryoterapi samt etablering, regenerering, oppformering og vedlikehold av plantemateriale under kontrollerte in vitro-forhold.
Genetiske ressurser og langtidsbevaring
Vedlikehold og sikring av vegetativt formerte sorter og annet verdifullt plantemateriale gjennom klonbanker, vevskultur og kryopreservering.
Forskning og metodeutvikling
Videreutvikling og tilpasning av diagnostiske metoder, rensemetoder, in vitro-lagring og kryopreservering til ulike plantearter.
Arbeidet stopper ikke når en virusfri plante er etablert. Materialet må kontrolltestes, vedlikeholdes, oppformeres og bevares. Arbeidet med friskt plantemateriale kobler derfor plantepatologi, molekylær diagnostikk, plantebioteknologi, genressursbevaring og praktisk dyrking.
Samarbeid
Arbeidet bygger på samarbeid mellom NIBIOs fagmiljøer og eksterne aktører. Samarbeidspartnerne omfatter blant annet: Norsk genressurssenter, Graminor, Overhalla klonavlssenter, Nasjonal klonbank for grønsaker på Landvik, Norges Vel, Slæpen gård, Datsja, Sagaplant, Njøs Frukt & Bær og PlantiNor.
Rapid population growth poses a major challenge to global food security. Promoting sustainable agricultural production is necessary to ensure the global food security. Horticultural plants are a high-valued part in agricultural production. Virus and viroid diseases have long been a key factor limiting the horticultural production. Cultivation and distribution of pathogen-free plants is currently the most efficient practice for managing virus and viroid diseases, and their spread in the landscape. Cryotherapy-based methods are recently developed novel biotechnologies for the efficient production of pathogen-free plants. This review outlines updated information on the development and advances in cryotherapy-based methods for efficiently eradicating viruses and viroids in horticultural plants. Mechanisms underlining cryotherapy-based methods for improved pathogen eradication are discussed, and suggestions for further studies are proposed.
We report the successful cryopreservation of three economically important Rubus viruses: raspberry bushy dwarf virus (RBDV), black raspberry necrosis virus (BRNV), and Rubus yellow net virus (RYNV), using shoot tip cryopreservation in four raspberry cultivars. Virus-infected shoot tips (approximately 1.0 mm in length) containing 3–4 leaf primordia (LPs) were cryopreserved using the droplet-vitrification technique. In the cultivars ‘Zlatá Královna (ZK)’ and ‘Tulameen (TUM)’, over 90% of shoot tips survived, and more than 90% regenerated into whole shoots. All three viruses were successfully preserved in the cryopreserved tissues, with recovery rates varying depending on virus type and cultivar: RBDV was recovered at rates of 86% in ‘ZK’ and 87% in ‘TUM’; BRNV at 66% in ‘ZK’ and 45% in ‘TUM’; and RYNV at 96%, 94%, and 86% in ‘Fairview’, ‘Stiora’, and ‘ZK’, respectively. To investigate viral localization in shoot tips, in situ hybridization was used. RBDV and RYNV infected a broad range of meristematic tissues, including the apical dome and LPs, whereas BRNV showed a more limited distribution. Virus distribution varied not only among virus species but also across raspberry cultivars, suggesting genotype-specific patterns of virus localization. Post-cryopreservation viral activity was verified using micrografting and aphid transmission assays. RBDV, BRNV, and RYNV were all successfully transmitted to healthy plants via micrografting, indicating the preservation of viral infectivity. Furthermore, BRNV was effectively transmitted by large raspberry aphids from cryopreserved materials, confirming vector-mediated transmission capacity post-thaw. Overall, this study demonstrates that shoot tip cryopreservation via droplet-vitrification is a reliable and effective strategy for preservation of biologically active Rubus viruses. This approach offers a valuable biotechnological tool for virus maintenance in support of diagnostic, breeding, and virology research.
This is the pre-peer reviewed version of the following article: Wang, M., Hamborg, Z., Ma, X., Blystad, D., & Wang, Q. (2021). Double‐edged effects of the cryogenic technique for virus eradication and preservation in shallot shoot tips. Plant Pathology, 71(2), 494–504. Portico, which has been published in final form at https://doi.org/10.1111/ppa.13466. This article may be used for non-commercial purposes in accordance with Wiley Terms and Conditions for Use of Self-Archived Versions."
submittedVersion
The present study described a droplet-vitrification cryopreservation for shoot tips of shallot (Allium cepa var. aggregatum),
a small bulb onion. Shoot tips taken from in vitro stock shoots were precultured with 0.3 M and 0.5 M of sucrose, with
1 day for each concentration. Precultured shoot tips were treated with a loading solution containing 2 M glycerol and 0.6 M
sucrose for 20 min and then exposed to plant vitrification solution 3 (PVS3) at 24 °C for 3 h of dehydration. Following
exposure to PVS3, shoot tips were moved onto 5.0 μl PVS3 droplets on aluminum foil strips, followed by direct immersion
into liquid nitrogen for 1 h. Frozen shoot tips were thawed by incubation in liquid MS medium containing 1.2 m sucrose for
20 min at room temperature, and then post-thaw cultured for shoot regrowth. Exposure of the shoot tips to PVS3 produced
shoot regrowth (58%). Differential scanning calorimetry (DSC) detected 1.8% of freezable water in the shoot tips that had
been dehydrated by PVS2, and no freezable water in those by PVS3 treatment. Exposure to PVS3 provided a broader safe
temperature range (− 196 °C to − 88 °C), compared to that (− 196 °C to − 116 °C) of PVS2, for cryopreserved samples.
Histological observations found that PVS3 dehydration allowed many cells in the apical dome and in the leaf primordia to
survive following freezing in LN, while PVS2 dehydration resulted in much fewer surviving cells in the apical dome. The
droplet-vitrification cryopreservation produced 56%, 72% and 32% shoot regrowth in cryopreserved shoot tips taken from
in vitro shoots, adventitious buds regenerated from stem discs and field-grown bulbs, respectively. Advantages and disadvantages
of the use of different source explants for cryopreservation were discussed. The droplet-vitrification cryopreservation
produced 45% and 70% shoot regrowth in the additional two shallot genotypes ‘Kverve’ and ‘Lunteviga’. The results obtained
in this study provide technical supports for setting-up cryo-bankings of genetic resources of shallots and other Allium species.